Gevaarlijkste Legionellabacteriën groeien optimaal bij 40°C of warmer
Van de meer dan 60 beschreven Legionellabacteriën is L. pneumophila de meest gevaarlijke. De soort is in ruim 95% van de gerapporteerde gevallen veroorzaker van veteranenziekte, zo ook bij de uitbraak in Bovenkarspel (1999).
De meeste ziektegevallen worden veroorzaakt door ST62 en ST47: twee sequentietypen of varianten binnen SG1, de serogroep van L. pneumophila met het hoogste aantal ziekmakers. In waterinstallaties worden beiden zelden waargenomen. Onderzoek wijst uit dat vertegenwoordigers van ST62 en ST47 optimaal groeien bij hogere temperaturen (≥ 40°C) dan andere vertegenwoordigers van SG1. De groei van alle teststammen bij 38°C komt overeen met die in een biofilm op zacht PVC. Loopt de temperatuur op tot 41°C, dan stopt de vermeerdering. Ook wordt in dat geval de vrijlevende amoebe Hartmannella vermiformis, een belangrijke gastheer voor L. pneumophila, niet aangetoond. ST62 en ST47 vereisen bij die temperatuur blijkbaar de aanwezigheid van een andere thermotolerante gastheer. Bij een temperatuur van 42°C zien we in de biofilm voor alle teststammen een sterke afname van het aantal Legionellabacteriën, evenals het ontbreken van H. vermiformis.
Belang: inzicht in de invloed van temperatuur op Legionellagroei in biofilms
Legionellabacteriën kunnen zich onder meer vermenigvuldigen in installaties voor warm tapwater en in koeltorens. Naar aanleiding van de grote uitbraak van veteranenziekte in Bovenkarspel in 1999, is in Nederland een strenge regelgeving ingevoerd, gericht op het tegengaan van deze levensbedreigende vorm van longontsteking die door L. pneumophyla wordt veroorzaakt. Maatregelen zijn voorgeschreven om groei van Legionellabacteriën in waterinstallaties zoveel mogelijk te beperken. Ondanks deze regelgeving worden in Nederland jaarlijks enkele honderden gevallen van veteranenziekte gerapporteerd, waarvan ongeveer de helft van de besmettingen binnen onze landsgrenzen plaatsvindt.
Om besmettingsbronnen te kunnen aanwijzen moeten Legionellabacteriën nauwkeurig worden geïdentificeerd. Dit gebeurt middels moleculaire technieken. Het blijkt dat de soort L. pneumophila, met 15 serogroepen, enkele duizenden sequentietypen (STs) omvat. Daarvan veroorzaakt slechts een beperkt aantal de meeste ziektegevallen. Een voorbeeld is L. pneumophila ST62, de bron van de uitbraak in Bovenkarspel. Opmerkelijk is echter dat de hoofdveroorzakers van veteranenziekte zoals ST62 en enkele andere STs vrijwel nooit in waterinstallaties worden aangetroffen. Hier vinden we soms wel andere Legionellabacteriën in hoge aantallen.
Het drinkwater in Nederland wordt gedistribueerd zonder een restgehalte van desinfectiemiddelen. Om groei van micro-organismen zoveel mogelijk te beperken, passen de drinkwaterbedrijven een uitgebreide zuivering toe. Deze haalt zo goed mogelijk afbreekbare stoffen uit het water, omdat deze al in zeer lage concentraties bevorderlijk zijn voor de vorming van biofilms waarin Legionellagroei kan optreden. Ons onderzoek richt zich erop duidelijkheid te scheppen in de vraag of, en zo ja onder welke omstandigheden, de meest virulente STs zich onder invloed van de temperatuur in een vloeibaar medium en in biofilms kunnen vermeerderen.
Aanpak onderzoek: bepaling Legionellagroei in biofilm bij temperatuurproeven
In het onderzoek is gebruikgemaakt van geselecteerde bacteriën van de soort L. pneumophila, behorende tot ST47, ST62 (waaronder stammen van de uitbraak van Bovenkarspel) en ST1 (het meest algemeen voorkomende type). Voor bepaling van de optimale en maximale groeitemperatuur werden de bacteriën in een vloeibaar rijk medium (buffered yeast extract bouillon) gebracht en aan temperaturen blootgesteld, variërend van ca. 22°C tot 44°C. Bij enkele stammen is de groei in biofilms op leidingen van zacht PVC (PVCP) vastgesteld. Dit gebeurde in glazen kolommen, geënt met reinculturen van geselecteerde teststammen. In de kolommen bevonden zich PVCP-segmenten waar leidingwater doorheen stroomde met een gecontroleerde temperatuur.
Bepaling van de samenstelling van de biofilm vond plaats aan de hand van het gehalte ATP (adenosinetrifosfaat). De aantallen Legionellabacteriën in de biofilm en in het water werden gemeten met behulp van de kweekmethode met BCYE agar, conform normvoorschrift NEN 6265-2007. Het aantal vrijlevende protozoa in de biofilm, die als gastheer kunnen optreden voor L. pneumophila (Hartmannella vermiformis en Acanthamoeba soorten), werd vastgesteld middels selectieve moleculaire detectiemethoden.
Resultaten: optimale Legionellagroei boven 40°C, in aanwezigheid van thermotolerante gastheer
De resultaten van het onderzoek laten zien dat de teststammen goed groeiden in het vloeibare medium, ook bij ca. 22°C. De optimale groeitemperatuur voor ST1 was ca. 37°C. Voor ST47 en ST62 bedroeg bedroeg dit respectievelijk ca. 40°C en ca. 42°C. ST1 stammen vermeerderden zich niet bij 42°C. Geen van de stammen groeiden bij 44°C.
Op de PVC segmenten in de kolommen met stromend leidingwater trad bij 38°C snel een sterke biofilmvorming op. De concentratie bedroeg 20 – 40 ng ATP/cm2, een waarde die 10 tot 100 keer hoger ligt dan biofilmconcentratie op glas in contact met drinkwater. In de biofilm vermenigvuldigden de teststammen van L. pneumophila ST1, ST47 en ST62 zich tot aantallen van 1á 2 x 107 kve/cm2. De teststammen van ST47 en ST62 groeiden onder deze condities in gelijke mate als ST1. In het water werden aantallen aangetoond van ca. 105 á 106 kve/l. Verhoging van de watertemperatuur tot 41°C gedurende 4 weken had geen effect op de biofilmconcentratie en op het aantal Legionellabacteriën, maar verdere verhoging tot 42°C leidde na eenzelfde tijdsperiode tot een sterke afname van het aantal Legionellabacteriën in de biofilm en in het water, terwijl de biofilmconcentratie (ATP) niet terugliep.
Uit metingen met moleculaire methoden werd bij 38°C in de biofilms de aanwezigheid van H. vermiformis aangetoond. Acanthamoeba werd niet waargenomen. Bij 42°C was het aantal H. vermiformis sterk afgenomen (ca. 100 x). Acanthamoeba ontbrak, evenals in de eerdere meting. Een volgend experiment, met doorstroming van de kolommen met PVCP-segmenten met leidingwater bij temperaturen van 38, 39, 40, 40,5 en 41°C, toonde opnieuw een snelle en sterke biofilmvorming aan. Bij 40,5°C groeide L. pneumophila (ST62) langzaam, bij 41°C was groei niet aantoonbaar. Bij dezelfde temperatuur ontbrak in de biofilm H. vermiformis.
Op grond van de waarnemingen blijken ST47 en ST62 goed te groeien bij temperaturen boven 40°C. Bij een temperatuur van 44°C treedt geen groei in de biofilm op, waarschijnlijk door het ontbreken van een geschikte gastheer. De literatuur vermeldt dat warmwaterinstallaties geschikt zijn voor thermotolerante varianten van H. vermiformis. Maar deze varianten lijken in drinkwater bereid uit grondwater met een temperatuur < 15°C te ontbreken.
Concluderend stellen we vast dat optimale Legionellagroei bij temperaturen boven 40°C alleen voorkomt in aanwezigheid van een thermotolerante gastheer in het systeem of in het aangevoerde water. Deze combinatie van factoren verklaart mogelijk waarom de isolatiefrequentie van bepaalde STs in waterinstallaties zo laag is.In aanvulling op thermisch beheer zoals hier is beschreven, kan toepassing van ultrafiltratie van voedingswater van installaties een bijdrage leveren in het tegengaan van de groei van virulente L. pneumophila typen en thermotolerante gastheerprotozoa. Dit zogenoemde poortwachterconcept is van belang voor de volksgezondheid zodat nodige maatregelen kunnen worden getroffen.Selectieve moleculaire detectiemethoden zijn geschikte toepassingen voor de uitvoering van dergelijk aanvullend onderzoek.
Uit: BTO-rapport april 2015 Effect of temperature on the growth of Legionella pneumophila sequence types 1, 47 and 62 in buffered yeast extract broth and biofilms exposed to flowing warm tap water Auteurs: Prof. Dr. Ir. Dick van der Kooij, ing. Harm Veenendaal, Anke Brouwer-Hanzens en ir. Bart Wullings
Redactie: Manon Laterveer-de Beer
In opdracht van: KWR Watercycle Research Institute
